Выдающиеся перепрограммисты

Нобелевскую премию по медицине присудили за изучение механизмов специализации клеток

Лауреатами Нобелевской премии по медицине и физиологии в 2012 году стали Джон Гардон и Синъя Яманака. Оба они посвятили свою жизнь исследованию того, как клетки приобретают свою тканевую специализацию и как можно обратить этот процесс вспять. Главные публикации лауреатов разделили 40 лет бурного развития биологии: когда Гардону удалось получить яйцеклетку с пересаженным от фибробласта ядром, Яманака еще только родился. В 2006 году японский исследователь в каком-то смысле завершил тот путь, по которому впервые пошел Гардон: ему впервые удалось перепрограммировать зрелую специализированную клетку и превратить ее в плюрипотентную стволовую, от которой она когда-то произошла. Медицинские перспективы этих исследований настолько широки, что некоторые уже сейчас сравнивают их с открытием антибиотиков.

Необратимость специализации

Все многоклеточные организмы вырастают из одной-единственной клетки - зиготы, то есть оплодотворенной яйцеклетки. Как только зигота начинает делиться и образовывать новые клетки, их судьбы расходятся: какие-то клетки становятся нейронами, какие-то - клетками жировой ткани. Отдельная линия клеток со временем дает начало новым яйцеклеткам или сперматозоидам.

Дифференцировку клеток иногда сравнивают с падением с горы: упасть и попасть в определенную "долину специализации" легко, но вернуться назад невозможно. Нажмите, чтобы увеличить.

Хотя каждая из клеток организма (за редкими особыми исключениями) имеет геном, идентичный геному зиготы, приобретенная специализация накладывает отпечаток на ее дальнейшую судьбу. Полностью созревшая клетка обычно не только не способна поменять свою специализацию, но часто даже не может делиться.

К примеру, фибробласт, полученный из брюшины мыши и пересаженный в культуральную среду, скорее всего просто погибнет спустя несколько делений. Чтобы этого не произошло, мы можем взять вместо обычных клеток раковые, то есть получить так называемую бессмертную (иммортализованную) линию. Раковые клетки способны делиться неограниченно долго, однако даже спустя десятки лет и десятки тысяч клеточных поколений они остаются такими же, как и были: фибробласты остаются фибробластами, а гепатоциты - гепатоцитами.

Конечно, даже у взрослого организма существуют слабо специализированные клетки, из которых получаются несколько видов зрелых клеток. Такие слабо специализированные клетки делятся и восполняют потери организма. В широком смысле их называют стволовыми клетками, а точнее - мультипотентными клетками. Именно из них формируются новые клетки крови, из них образуются новые клетки эпителия (смена которого, между прочим, так же важна для существования организма, как и гематопоэз), они осуществляют регенерацию поврежденных тканей.

Для человека необратимость клеточной специализации означает одно: возможности регенерации тканей у взрослого организма оказываются крайне стесненными. Потеряв значительное число стволовых клеток, организм со временем перестает возобновляться, начинается необратимое старение. Например, хорошо известно, что стволовые клетки мозга почти полностью исчезают еще во время внутриутробного развития и в дальнейшем не восстанавливаются. Они остаются в дремлющем состоянии и активируются например, при инсульте. Однако, тот нейрогенез, который происходит во взрослом возрасте, расходует невосполнимый ресурс этих клеток и в конце концов заканчивается.

Интересно, что даже естественный отбор в данном случае играет против человека. Ресурса оставшихся с эмбрионального развития стволовых клеток обычно хватает на то, чтобы дожить до репродуктивного возраста, а то, что происходит потом, отбор "не интересует". Скорее наоборот - при появлении мутации, которая хоть немного способствует размножению, но при этом сокращает возможности регенерации во взрослом возрасте, она будет отобрана и сохранится в поколениях.

Фантастический эксперимент

Джон Гардон (Sir John B. Gurdon). Фото пользователя Rubenstein с сайта Flickr

Представление о необратимости клеточной специализации сформировалось в первой половине двадцатого века, еще задолго до открытия структуры ДНК. Биологи прошлого, конечно, не знали всех тех деталей этого процесса, которые мы знаем теперь, но они твердо понимали одно: животные не размножаются почкованием и, в отличие от растений, из их клеток нельзя получить эмбрион.

Тем не менее, еще в это время, в 1935 году, немецкий эмбриолог Ханц Шпеман предположил, что каким-то образом процесс клеточной специализации можно повернуть вспять.

В своем классическом эксперименте он показал, что клетки эмбриона на самых ранних стадиях развития обладают тотипотентностью, то есть способны развиться в полноценный организм. Для этого он перетягивал оплодотворенную икринку саламандры с помощью волоска так, чтобы ядро оказалось отделено от цитоплазмы. После того как ядро проходило несколько первых делений, Шпеман ослаблял натяжение и позволял одному из 16 образовавшихся ядер проникнуть через перемычку в цитоплазму. Затем, ученый перемычку затягивал вновь, и на этот раз до конца. При этом у него получалась клетка, имеющая цитоплазму зиготы и ядро одного из бластоцитов. Оказалось, что из такой клетки впоследствии развивается полноценное животное, а значит, по крайней мере во время первых четырех делений, никакой специализации в эмбрионе не происходит.

Именно Шпеман первым предложил "фантастический эксперимент", в ходе которого ядро зрелой клетки предполагалось пересадить в некую лишенную ядра цитоплазму, в которой оно сможет проявить свой потенциал развития.

В 1955 году такой эксперимент на леопардовой лягушке Rana pipiens удалось осуществить Бригсу и Кингу. Они показали, что ядро зрелой клетки при переносе в цитоплазму не способно, в отличие от ядра эмбриона, дать полноценный организм. Из чего ученые сделали вывод о том, что после какого-то деления специализация становится необратимой и ядро теряет свой потенциал развития.

Гардон удалял ядро из яйцеклеток при помощи УФ-облучения, а затем инъецировал в них ядро из эпителия головастика. Из полученной клетки развивалась нормальная лягушка. Впоследствии эту технологию применили для овец, мышей, свиней, собак и других животных.

Однако то, что основано, как полагали ученые, на фундаментальном законе природы, оказалось всего лишь неудачей при выборе объекта. Нынешнему нобелевскому лауреату, Джону Гардону, который в то время работал в Оксфорде, повезло гораздо больше: вместо леопардовой лягушки он для своих экспериментов выбрал шпорцеву (род Xenopus). И там, где Бригс и Кинг потерпели неудачу, Гардон добился блистательного успеха: ядра, взятые из эпителиальных клеток головастика, при переносе в безъядерные яйцеклетки амфибий оказались способны развиваться в полноценных лягушек.

Полученные Гардоном результаты были настолько удивительными, что очень многие биологи отнеслись к ним весьма настороженно. Ученому пришлось много раз повторять эксперимент во все новых вариациях, чтобы убедить научное сообщество в своей правоте. В частности, в 1966 году ему удалось повторить эксперимент, используя ядра не из головастиков, а из половозрелых лягушек. Кроме того, он также использовал эмбриональные ядра и добился идентичного результата.

Эксперимент Гардона изменил парадигму мышления эмбриологов его поколения и вошел во все приличные учебники биологии. Именно этот эксперимент стал основой технологии клонирования овечки Долли, которое по какой-то причине широкой публике известно лучше, чем открытие англичанина. За прошедшие 50 лет технология клонирования сильно изменилась технически и расширила спектр подвластных ей организмов, но принцип, заложенный Гардоном, остался тот же.

Японское чудо

Синъя Яманака (Shinya Yamanaka) Фото Rubenstein

К началу 2000-х годов биологи уже понимали, что перепрограммировать соматическую клетку и получить из нее стволовую вполне возможно. В это время ученые уже имели развитую технологию пересадки ядер и, что не менее важно, методы массового анализа активности генов в разных тканях и разных клетках. С другой стороны, все понимали, что такая работа потребует тщательного планирования, очень большого числа попыток и может длиться годами. Забавно, что проделать эту кропотливую работу впервые удалось именно японцу.

Синъя Яманака, как уже было сказано, родился в том же 1962 году, когда вышла статья Гардона. Он получил медицинское образование и даже проработал несколько лет в Национальном Госпитале в Осаке. В середине 90-х годов Яманака уехал в Америку и работал в Калифорнийском университете, но эксперименты, которые принесли ученому мировую славу и Нобелевскую премию, он осуществил на родине, где работает и до сих пор.

Японский ученый проанализировал те гены, которые всегда "включены" в эмбриональных стволовых клетках, но не работают у зрелых клеток организма. Среди них ученый выделил гены 24 транскрипционных факторов - регуляторных белков, которые включают или выключают работу других генов.

Обычно работа транскрипционных факторов построена по иерархическому принципу - транскрипционные факторы высокого уровня включают определенные гены более низкого уровня, которые, в свою очередь, также кодируют транскрипционные факторы. Все эти гены работают как некие переключатели, которые управляют "переводом стрелок" на путях развития клеток. Их взаимодействие происходит обычно очень сложно, и связи между транскрипционными факторами разного уровня часто представляют собой "мешанину", в которой очень непросто разобраться. Кроме того, говоря о работе генов, необходимо учитывать, что биология до сих пор, в общем-то, не количественная наука и информации о конкретных концентрациях, в которых работают транскрипционные факторы, обычно не существует.

Все это позволяет представить тот уровень смелости, который потребовался Яманаке, чтобы осуществить свой эксперимент. Чтобы включить в соматических клетках "стволовые" транскрипционные факторы, он вводил их гены в перманентно активном состоянии в составе вирусных частиц в зрелые клетки соединительной ткани. При этом активные гены транскрипционных факторов встраивались непосредственно в хромосомную ДНК этих клеток. Вместо того чтобы вводить эти гены постепенно, Яманака сразу внедрил 24 гена-кандидата, а затем по одному удалял их из этой гигантской конструкции, наблюдая за изменением поведения клеток.

Таким образом ему удалось найти четыре гена: Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, активации которых было достаточно для того, чтобы превратить фибробласт в стволовую клетку, способную стать любой клеткой организма (за исключением трофических клеток плаценты). Такие клетки Яманака назвал индуцированными плюрипотентными клетками (iPC), чтобы отличать их от исходных эмбриональных плюрипотентных клеток.

Работа японского ученого сразу стала настоящей сенсацией в биологии: в 2007 году уже был понятен потенциал использования стволовых клеток. Кроме того, ученые уже столкнулись с большими препятствиями при работе с эмбриональными стволовыми клетками: об их правах стали говорить организации озабоченных граждан. Использование же индуцированных стволовых клеток давало ученым карт-бланш, так как снимало все этические проблемы, связанные с работой с эмбрионами.

В последующие годы ученым удалось существенно улучшить технологию Яманаки и глубже понять механизм перепрограммирования.

В мышиный фибробласт Яманака вводил гены транскрипционных факторов (представлены пробиркой). Нажмите, чтобы увеличить.

Основные сложности с оригинальной методикой заключались в том, что введенные гены продолжали работать даже тогда, когда это было не нужно. В следующем после публикации 2008 году стало понятно, что при работе с нервными стволовыми клетками можно для индукции плюрипотентности использовать не четыре, а всего два гена транскрипционных факторов. Кроме того, используя индуцированную рекомбинацию, эти гены можно было удалить после использования.

Затем, в 2009 году, той же группе ученых удалось перепрограммировать клетки вообще без встраивания генов транскрипционных факторов в ДНК - в новом варианте они вводились на временной "флешке", плазмиде, которая затем при делении клеток терялась.

В том же году группе китайских ученых удалось показать, что из полученных методом Яманаки клеток iPC могут развиться нормальные эмбрионы. Для этого ученым пришлось пойти на хитрость: использовать помимо iPC также их тетраплоидные гибриды - клетки, получившиеся в результате слияния исходных iPC. Из них в дальнейшем развивалась плацента, а из исходных клеток - эмбрион. Мышку, полученную таким образом, ученые назвали Tiny (подробнее об этом можно прочитать, например, здесь.)

Вместо заключения

Научное и медицинское значение работы Яманаки стало понятно специалистам еще в 2006 году. Мало кто из биологов сомневался, что японскому ученому когда-нибудь достанется Нобелевская премия. Неожиданностью оказалось скорее то, что это произошло так быстро. С другой стороны, Гардону заслуженной награды пришлось ждать ровно полвека.

Все по сюжету

Нобелевские премии - 2012

Получение индуцированных стволовых клеток в произвольном количестве потенциально способно снабдить человека инструментами активации регенерации и продления жизни. Наиболее очевидное их применение связано с лечением болезни Паркинсона или бокового амиотрофического склероза. Однако до этого пока еще очень далеко. Все-таки те транскрипционные факторы, которые возрождают в соматических клетках былые эмбриональные способности, не зря называются онкогенами - безопасность их использования еще предстоит проверить и перепроверить.

Пока же ученые получили замечательную технологию для изучения механизмов дифференцировки клеток, а широкая публика - захватывающую научную историю протяженностью в 50 лет.

Александр Ершов

Lenta.ru: Прогресс: Выдающиеся перепрограммисты