Тесты на антитела к коронавирусу нужны для поиска переболевших и лечения больных. Мы поговорили с учеными, которые их разрабатывают

Тестирование является одним из важнейших инструментов борьбы с пандемией коронавируса. Однако в России, да и в большей части мира, до сих пор использовался только один вид тестирования — детекция РНК вируса в материалах мазков. Другой тип анализа — поиск антител к коронавирусу в плазме крови. Без него, например, невозможно установить реальную долю переболевших в популяции и нельзя найти тех, кто мог бы стать донором плазмы крови. Российские власти уверяют, что уже скоро тесты на антитела, созданные в новосибирском научном центре «Вектор», будут назначаться медработниками, однако подробностей об устройстве и характеристиках этих тестов пока очень мало. Мы поговорили с учеными, которые самостоятельно занялись созданием российских тестов на антитела к коронавирусу, причем еще до того, как в том же направлении стало двигаться государство.

Зачем нужны тесты на антитела

При тестировании на коронавирус существуют несколько подходов, которые отличаются и технологией, и точностью, и тем, на какой фазе заболевания можно проводить тестирование:

• Детекция РНК вируса в мазках, которые берут из носоглотки, ротоглотки или слюны. В подавляющем большинстве случаев детекция проводится с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР), хотя есть и несколько более экзотических вариантов решения той же задачи. Метод занимает от нескольких часов до суток, он позволяет определить, может ли человек быть носителем и распространителем вируса.
• Компьютерная томография. С ее помощью врач может заметить патологические изменения в легких, которые происходят во время инфекции, причем независимо от того, присутствует ли вирус в мазках. Это довольно быстрый метод (несколько минут на томографию плюс анализ), и в Китае какое-то время его применяли как основной способ тестирования. Однако позже, из-за большого числа ложноположительных результатов, врачи решили вернуться к обычному ПЦР-тестированию.
• Анализ на антитела. Он позволяет обнаружить, сталкивался ли человек с вирусом или нет до настоящего момента и как его иммунная система отреагировала на такое столкновение. В одном из вариантов этот анализ может проводиться по мельчайшей капле крови и давать результат всего за 15 минут.

Ни один из трех методов не является универсальным, и каждый из них имеет свои недостатки. Например, во время инфекции самый быстрый результат дает ПЦР-тест, в то время как иммунный ответ и выработка антител требуют значительного времени (10 дней и больше). Однако антитела против вируса остаются в крови существенно дольше, чем вирус в мазках, поэтому только тест на антитела может ответить на вопрос о том, сталкивался ли человек с COVID-19 раньше или нет и есть ли у него иммунитет к инфекции. Как долго может сохраняться такой иммунитет — важный вопрос, который имеет непосредственное отношение к тому, можно ли будет заразиться COVID-19 повторно. Пока на него нет ответа: слишком мало времени прошло для того, чтобы делать какие-то выводы на этот счет.

Кроме того, есть еще одна причина, по которой врачам необходимы тесты на антитела — это потенциальная возможность использовать сыворотку переболевших людей для лечения новых пациентов. Такой метод терапии уже использовался для лечения SARS, MERS и других вирусных заболеваний и показал свою потенциальную эффективность. И хотя применимость этого метода именно для COVID-19 еще предстоит доказать в клинических исследованиях (которые начались, например, в Великобритании), без эффективных тестов на антитела у врачей не будет возможности даже начать такие исследования.

Как работают такие тесты

Есть несколько довольно похожих вариантов детекции антител в крови, но для каждого из них принципиально важный этап заключается в том, чтобы выбрать и синтезировать в достаточном количестве подходящий антиген — ту самую молекулу вируса, с которой связываются антитела крови.

Технически метод работает так: белок-антиген наносят на подложку, затем туда же помещают каплю крови (сыворотки) испытуемого, а потом отмывают ее солевым раствором. Если человек уже переболел исследуемой инфекцией и в его крови появились антитела к возбудителю, то они свяжутся с белком на подложке и останутся там даже после тщательной отмывки остальных компонентов крови. После этого присутствие антител на подложке можно подтвердить с помощью стандартного метода детекции любых человеческих антител — на этом этапе уже не важно, были ли это антитела против нового вируса или против какой-то другой нерелевантной инфекции.

Второй этап никак не зависит от природы возбудителя и, соответственно, для создания нового тест-набора он не очень важен — достаточно использовать стандартные реактивы. Однако первый этап требует подбора и синтеза в достаточном количестве именно нового вирусного белка — он должен отличать новый возбудитель от всех его вирусов-родственников.

Ни заранее, ни удаленно сделать это невозможно — для этого требуется получить образец «живого» вируса или иметь хотя бы фрагмент его генома. Кроме того, при неудачном выборе антигена разработка теста может легко провалиться на самом последнем этапе — например, если исходно выбранный в качестве антигена белок в реальности не вызывает у людей выработку антител, а основную иммунную реакцию обеспечивает совершенно другой антиген. По всем этим причинам создание серологического теста, то есть анализа по сыворотке крови — проект гораздо более трудоемкий и сложный, чем создание тест-наборов для ПЦР. Однако, как уже было сказано выше, без серологического тестирования ответить на многие принципиальные вопросы относительно новой эпидемии все равно будет невозможно.

Что сделали российские ученые

В Китае публикации о первых тестах на антитела стали появляться еще в конце февраля, а к настоящему моменту есть уже множество вариантов такого анализа. Наиболее полный список подобных тестов можно увидеть в еженедельном обзоре Университета Сингапура, однако большинство из приведенных там тестов либо еще не сертифицированы для применения, либо коммерчески не доступны за пределами стран-производителей. Исключениями являются лишь несколько компаний — например, немецкая Euroimmune Ag и китайско-американская BioMedomics, которая, по некоторым данным, продала уже полмиллиона тестов в Китае.

Для применения в России тестам требуется обязательная сертификация, однако о том, чтобы какой-либо из тестов вышеупомянутых производителей ее проходил, в новостях не сообщалось. Зато сообщалось о намерении Роспотребнадзора самостоятельно разработать тесты на базе новосибирского «Вектора». Однако еще до того, как в Роспотребнадзоре заговорили о таких планах, российским ученым удалось получить первые результаты работы в этом направлении. Создание первых российских тестов подобного рода инициировал Александр Иванов из Института молекулярной биологии имени Энгельгардта РАН, буквально за несколько дней к его инициативе подключились коллеги из Гематологического центра Минздрава во главе с Григорием Ефимовым и Екатериной Померанцевой из компании «Генетико». Мы поговорили с Ефимовым и Ивановым о том, что уже удалось сделать, как продвигается дальнейшее создание тестов и почему ведущаяся сейчас работа важна не только для тестирования, но и для исследования особенностей течения заболевания у разных людей.

Александр Иванов, заведующий лабораторией Института молекулярной биологии РАН

Нужно сразу сказать, что мы были далеко не первыми, кто понял, насколько важны сейчас серологические тесты. Прежде всего, следует отдать должное Флориану Краммеру, профессору Медицинской школы Маунт-Синай в Нью-Йорке, который специализируется на вирусах гриппа и у которого очень хорошая экспертиза в этом вопросе. Еще в декабре, до того, как китайские медики объявили, что речь идет о новом коронавирусе, еще до публикации его генома, он и его ближайшие коллеги пристально следили за ситуацией и одними из первых стали говорить о том, что без тестов на антитела, причем произведенных в огромном количестве, справиться с эпидемий будет невозможно.

Где-то в середине марта Краммер в своем твиттере написал о том, что ему удалось создать плазмиду для синтеза полноразмерного S-белка («шипа») нового коронавируса и его укороченного фрагмента — того самого, который связывается с рецепторами на поверхности человеческих клеток. Такая плазмида позволяет нарабатывать большое количество этого белка в культурах клеток млекопитающих. Краммер готов был предоставить ее любым желающим. В тот же день (это была пятница) я ему написал, и уже к следующей пятнице плазмида была у нас.

Вообще говоря, мы просто решили попробовать. Наша группа коронавирусы не изучает, мы исследуем другие инфекции, занимаемся классической вирусной биохимией, но мы поняли, что должны просто попробовать, начать эту работу — а дальше, может быть, подключить к ней кого-то еще. Мы — я и еще несколько человек из разных лабораторий ИМБ РАН — провели первые эксперименты, наработали некоторое количество этого вирусного белка. Подобрали количество антигена, разведение антител, условия тестирования и так далее. Однако систем, которые позволяют синтезировать белки в больших, более-менее «промышленных» масштабах и тех условиях, для которых, собственно, и была сделана плазмида, у нас, конечно, не было. Но как только мы начали свою работу, мне позвонил Григорий Ефимов — бывший коллега по ИМБ, который сейчас возглавляет лабораторию в Гематологическом центре. Он тоже искал возможность заняться ровно тем же самым, что и мы, но уже на своих, более широких мощностях. Я ответил, что то, что он ищет, у меня буквально лежит сейчас на столе и мы, конечно, в тот же момент стали сотрудничать. Сейчас мы работаем параллельно, хотя у нашей группы, конечно, и ресурсов поменьше, и работать с клиническими образцами мы как исследовательский институт не имеем права, да и сейчас уже почти все закрыто на карантин.

Григорий Ефимов, заведующий лабораторией трансплантационной иммунологии «НМИЦ гематологии»

Мы в какой-то момент поняли, что оставаться в стороне уже просто неправильно. И раз уж у нас на руках есть какие-то инструменты, работающая лаборатория и опытные люди, то нам тоже надо подключаться к этой работе — созданию тест-систем и, шире, к исследованию коронавирусной инфекции.

Нашей главной задачей, по большому счету, был даже не сам тест, а исследование того иммунного ответа, которым сопровождается коронавирусная инфекция: реакция Т-клеток иммунной системы, ее особенности у разных людей в зависимости от их наследственности и другие подобные вопросы. В зависимости от того, каким окажется Т-клеточный ответ, мы можем столкнуться либо с ситуацией, когда у переболевших возникает пожизненный стойкий иммунитет, либо когда вирус, наоборот, приобретает способность уходить от ответа, меняя свои антигены, и ситуация напоминает скорее сезонный грипп, при котором возможно повторное заражение.

Исходно мы получили образцы белка от коллег из ИМБ, проверили, как с ним связываются антитела из сыворотки крови переболевших, затем начали делать белок самостоятельно и дальше уже стало понятно, что эту работу нужно обязательно доводить до практического применения. Потому что Т-клеточное исследование — это важная, но очень долгая история, а тесты нужны прямо сегодня, и мы можем их сделать. Тесты нужны и для того, чтобы узнать, сколько людей уже переболели в популяции, в том числе бессимптомно, они нужны и для того, чтобы отбирать людей с высоким титром (концентрацией) антител для переливания их плазмы больным.

Когда мы начинали, еще ни о каких российских серологических тестах — ни от «Вектора», ни от кого-либо еще — не было известно, и никаких публичных подвижек в эту сторону не было. Прекрасно, что теперь они появились. Дело в том, что тесты на антитела могут быть на самом деле довольно разными и они часто не заменяют, а дополняют друг друга. Например, по одной из недавних публикаций из Китая, где описан тест, в котором в качестве антигена используется N-белок вируса, оказалось, что у 95% людей, положительных по ПЦР-анализу РНК вируса, вырабатываются антитела к этому N-белку. Однако, зная иммунологию, мы можем точно сказать, что антитела должны вырабатываться во всех 100% случаев, а значит у остальных 5% людей был иммунный ответ на какой-то другой белок — и такие антитела этим тестом будут просто не видны. Мы не знаем, какой именно антиген использует «Вектор» и насколько хорошо он работает, поэтому наш тест безусловно будет небесполезен, даже если у «Вектора» все получится замечательно.

При создании теста мы начинали с полноразмерного S-белка — того самого «шипа», который выдается над поверхностью вирусной частицы. Но сейчас мы уже ушли от этого варианта и переходим на обрезанную версию, на фрагмент, который быстрее и проще получать в культуре клеток. И по нашим предварительным данным, он должен работать не хуже, чем полноразмерный вариант.

Сейчас мы находимся на стадии валидации, то есть нам нужно удостовериться, что наш тест работает, что он достаточно чувствителен и специфичен. Для этого используются положительные и отрицательные образцы, то есть нам нужна сыворотка переболевших людей и тех людей, которые с новым коронавирусом точно никогда не сталкивались. Со вторыми проще, мы в Гематологическом центре можем использовать образцы крови, которые были получены еще до того, как началась эпидемия и использовать их как отрицательный контроль. Но нам все равно нужны переболевшие — хотя многие уже откликнулись на наш призыв в соцсетях и у нас сейчас есть какая-то выборка из положительных образцов. На ней, на этой ограниченной выборке, нам все нравится — и чувствительность, и специфичность, но это, конечно, не исключает того, что в какой-то момент придется откатиться назад и что-то подкорректировать. Но по крайней мере из того, что мы видим сейчас, можно сказать, что рабочий прототип у нас уже есть.

Следующий этап — это производственная площадка, где нужно будет все собрать уже не в лабораторных, а в промышленных условиях и подготовить первую партию тестов для получения регистрационного удостоверения. Надеемся, что это пройдет быстро — по крайней мере, сейчас процедура всех диагностик, которые связаны с коронавирусом, существенно упрощена, и все эти запретительные регуляторные сложности существенно ослаблены Минздравом.

В самом процессе производства белка никакой особенной проблемы нет — уже сейчас в наших лабораторных условиях мы получили около 200 миллиграммов белка — при том что на один тест используется примерно в 100 тысяч раз меньше антигена. Возможно, в ближайшее время к процессу подключатся уже коммерческие компании, которые занимаются таким производством профессионально. Может быть, это позволит выиграть время, но пока этот вопрос не решен.

Наш тест будет сделан в планшетном формате, его можно будет использовать в лаборатории, но потенциально тот же белок и такие же тесты можно реализовать и в формате lateral-flow assay, то есть простых тест-полосок. Мы с таким форматом никогда не работали, мы занимаемся совсем другими вещами, но у нас уже есть знакомые, которые это хорошо умеют делать. Вообще, удивительно, как легко сейчас все подключаются к этой работе — все готовы делиться и своими реагентами, которые у кого-то есть в запасе, но которые сейчас очень сложно заказать, готовы пускать на свое оборудование, готовы давать расходники, которые у них еще остались. Коммерческие компании нам в дар передают какие-то расходные материалы для того, чтобы ускорить как-то нашу работу. У нас тоже нет сейчас никакого целевого финансирования на этот проект, пока все это делаем из собственных средств, которых, в общем, не очень много. Но за счет того, что все сейчас очень активно сотрудничают, все помогают, процесс идет.

От редакции: Если вы переболели COVID-19 и хотите принять участие в исследовании, напишите о себе на covid_donor собака blood.ru

Александр Ершов