Как биохимики научились не только смотреть, но и трогать. Нобелевскую премию по химии вручили за редактирование геномов — объясняем, как это работает

Нобелевскую премию по химии в 2020 году получили первооткрыватели метода редактирования геномов с помощью системы CRISPR/Cas9 — Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна. Этот метод — один из самых известных прорывов в биологии за последние годы, да и в науке вообще. Он открыл прямой путь к технологии настоящего (а не симптоматического) лечения генетических заболеваний. Он уже применяется при терапии рака и полностью революционизировал биотехнологию, заменив собой множество старых и ненадежных методов работы с геномами растений и микроорганизмов. В общем, редактирование геномов — именно то направление в науках о жизни, где можно было ожидать Нобелевскую премию. И самое интересное в решении комитета, наверное, даже не то, что премию дали за «криспы», а то, кому именно ее дали, а кому — нет.

Очень личное начало

Писать о долгожданном присуждении нобелевской премии за «криспы» — то есть за систему редактирования геномов CRISPR/Cas9 — почему-то необъяснимо приятно. Вроде бы и премию дают не тебе, и поработать с новой технологией собственными руками по какой-то случайности не довелось (несмотря на большое количество ближайших коллег, которые внесли в исследование этих систем вполне ощутимый вклад). Однако и перспективы этого открытия, и скорость, с которой оно проделало свой путь от статьи в Science до пресс-релиза Нобелевского комитета, конечно, впечатляют и заставляют сопереживать.

Еще вроде бы совсем недавно ты пишешь базовый разбор CRISPR/Cas9 с полуироничным заголовком «Запомните эти буквы» и упоминанием Нобеля, и вот через четыре года за это действительно дают ту самую премию. Возможно, дело в том, что подобные вещи вселяют в тех, кто следит за развитием науки, какую-то подзабытую веру в большие, быстрые, практически значимые и, что тоже немаловажно, персональные достижения — что-то в духе XIX века. Наука в последние десятилетия все больше и больше становилась делом коллективным, долгим и организационно сложным, причем не только в физике, но и в науках о жизни. И такие редкие исключения, где можно за несколько лет дойти от базового proof-of-principle до клинических исследований на людях и Нобелевской премии, на этом фоне особенно выделяются и особенно приятны.

Зачем вообще понадобился метод редактирования геномов

«Трудно вспомнить другое революционное открытие, которые захватило бы всю биологию так быстро, как CRISPR», — пишет в своем важнейшем историческом обзоре профессор Массачусетского технологического института Эрик Лэндер. Чтобы понять, откуда такие громкие слова, нужно представить, как вообще молекулярные биологи общаются со своим главным объектом — живыми организмами и их геномами.

Если открыть любой учебник биологии на разделе, где рассказывается о ДНК, РНК, синтезе белка и прочих сложных молекулярных процессах, там обычно можно увидеть множество очень красивых, ярких и запоминающихся картинок: вот рибосома шагает по РНК-копии гена, одновременно сматывая в клубок синтезирующийся белок; вот похожая на большую варежку ДНК-полимераза движется по ДНК, выпуская за собой ее новую копию, ну и другие тому подобные вещи.

Интуитивно кажется, что все это — результат того, что ученые смогли как-то хитро выделить эту живую систему в отдельной пробирке и рассмотреть с помощью очень мощного микроскопа, как же взаимодействуют все эти красивые молекулярные машины друг с другом. Однако чем более подробный (и более грамотный) учебник оказывается у нас в руках, тем меньше в нем занимают места эти красивые (и даже правильные) схемы и тем больше появляется описаний растворов, таблиц и фотографий каких-то гелей с черно-белыми пятнами в разных местах.

Все дело в том, что в отличие, скажем, от анатомов, зоологов или физиологов, молекулярные биологи почти никак (а до недавнего времени просто никак) не могли видеть то, с чем, собственно, приходится работать. Можно, конечно, при большом желании выделить из клеток побольше ДНК, высушить ее и попробовать что-то там рассмотреть (она будет похожа на белую вату), но никакого смысла в этом не будет совершенно. Молекулярный биолог не может увидеть, как отдельная молекула белка нашла нужный участок гена, села на него и активировала его работу. Но это можно увидеть в эксперименте — по расположению тех самых пятен на геле. Биолог не может взять и вручную с помощью очень тонкого пинцета поменять пару «букв» в ДНК, чтобы посмотреть, как изменится работа организма, — но вполне может сделать это в пробирке, вслепую, с помощью тех инструментов, которые в ходе эволюция произвела сама природа. Другое дело, что такой инструмент нужно еще найти, понять, как его использовать, и грамотно применить для дела.

Конечно, еще до того, как в 2012 году Дудна и Шарпантье представили технологию целенаправленного разрезания ДНК с помощью «молекулярных ножниц» CRISPR/Cas9, биологи как-то справлялись с манипуляцией ДНК и редактировали геномы некоторых организмов. Это понятно хотя бы из того, что обсуждения ГМО начались задолго до этой работы, а как-то эти организмы сделать надо было — значит, и инструменты для этого были.

Однако здесь, как обычно, самое важное прячется в деталях. А они заключаются в том, что граница возможного и невозможного в то время была очень размытой: например, если то, что вы хотите сделать для редактирования генома, перенести с бактерии на какие-нибудь одноклеточные грибы, то придется сменить весь арсенал инструментов, и еще не факт, что из этого что-то выйдет.

Самая частая генетическая модификация — трансформация бактерий — это такая простая и прямолинейная процедура, что ей можно научить любого любопытного школьника за пару часов (клетки + буфер + ДНК + полторы минуты в термостате, потом на лед). Но как только мы перейдем от бактерий, например, к дрозофилам, то понадобятся уже гораздо более сложные инструменты и долгие процедуры. Сделать мышей, которые несут в своем геноме мутацию, соответствующую какой-то генетической болезни человека, — это задача для хорошей лаборатории на несколько месяцев. А если мы хотим что-то поменять уже в человеческих клетках, да еще и не оставив лишних следов, — то тут буквально до последнего времени биологи в какой-то степени превращались в астрономов: смотреть можно, трогать — нельзя.

В общем, чтобы понять, что именно имеется в виду под «редактированием геномов» в емкой формулировке Нобелевского комитета, нужно понимать, что вообще было возможно до самого открытия. А это довольно сложно, потому что подразумевает знание вообще всего молекулярно-биологического арсенала. Но на практическом, приземленном уровне сделать это все-таки можно. Если до 2012 года редактирование геномов было искусством, где нужно было владеть тысячью всяких инструментов и многолетним опытом хождения по граблям, то после 2012 года искусство превратилось в прямолинейную технологию: синтезировал нужный кусок ДНК, сделал пару генетических конструкций, ввел их в клетки — и вуаля, ваш отредактированный геном готов.

Как это работает

Непроизносимая аббревиатура CRISPR/Cas9 скрывает источник происхождения этого нового удивительного инструмента. CRISPR — это встречающиеся в бактериальных геномах особые странные повторы, clustered regularly interspaced short palindromic repeats, то есть расположенные кластерами короткие палиндромные повторы со спейсерами. На человеческом языке — это геномная картотека вирусов, с которыми приходилось сталкиваться данной бактерии или ее предкам и которые она знает и умеет уничтожать. Cas9 — часть этой системы, один из генов, которые обычно расположены рядом с такими картотеками, он кодирует белок, который, собственно, и уничтожает вирусы. Это фермент, который использует направляющие РНК, взятые из картотеки, для атаки на вирусы и уничтожения их ДНК. По своей задаче и немного по устройству система CRISPR похожа на систему РНК-интерференции у высших животных, только последняя по какой-то странной прихоти судьбы была открыта раньше, чем гораздо более простая для изучения бактериальная система.

Системы CRISPR у разных бактерий бывают разными, да и на самом деле они характерны не только для бактерий, но и для архей — именно у них они были впервые обнаружены и исследованы испанским исследователем Франсиско Мохико в 1993 году. Cas9 встречается не во всех таких системах, а только в самых простых из них (типа II) — тех, которые впоследствии стали широко использоваться для геномного редактирования. Системы типа I гораздо сложнее и разнообразнее (о них, например, можно почитать здесь), там множество разных компонент, но для геномного редактирования они не применяются — слишком это сложно. Тем не менее полезно помнить, что все эти инструменты, которые рассматриваются сейчас прежде всего как инструмент для решения наших, человеческих, проблем, вообще говоря, были открыты в исследованиях, которые с человеком никак не связаны и на которые, можно быть уверенными, давали деньги гораздо менее охотно, чем на заявки со словами «лечение рака».

Кто победил в сумасшедшей научной гонке

Работа, за которую сегодня дали Нобелевскую премию, состоялась только в 2012 году. Но между 1993-м, когда вышла первая статья Мохико, и 2012-м, когда вышла статья Шарпантье и Дудны, произошло много очень важного для их открытия — пересказать это, не вдаваясь в детали, невозможно. Да и не очень нужно — вся история открытия подробно разобрана еще в 2016 году профессором MIT Эриком Ландером, а его субъективный взгляд хорошо оттеняют последующие комментарии самих Дудны и Шарпантье.

Главное, что события вокруг исследования CRISPR происходили по какой-то ужасно быстрорастущей функции: сначала на странные повторы в бактериальных геномах очень долго почти никто не обращал внимания. Затем постепенно работы французского биолога российского происхождения Александра Болотина, вирусолога Евгения Кунина, французских исследователей, занимавшихся производством йогуртов для Danone, и многих других ученых привлекли к теме критическую массу внимания. Постепенно стало ясно, насколько это важная и большая тема, — и к 2012 году началась настоящая безумная гонка. Гонка за то, чтобы первыми создать из бактериальной системы противовирусного иммунитета универсальные геномные ножницы, шла на таких скоростях, что счет пошел буквально на дни и месяцы.

В начале 2012-го к решению задачи ближе всего подошли две группы: группа нынешних лауреатов Дудны и Шарпантье и группа литовского биохимика Виргиниюса Шиксниса. Обе они в конце концов смогли сделать, в принципе, одно и то же: научили бактериальный фермент совершать любые нужные разрезы в пробирке. Дальше можно процитировать Эрика Ландера:

Шикснис представил свою статью в журнале Cell 6 апреля 2012 года. Шесть дней спустя журнал отклонил статью без рецензирования (оглядываясь назад, редактор Cell соглашался, что статья оказалась очень важной). Шикснис сократил рукопись и отправил ее 21 мая в журнал Proceedings of the National Academy of Sciences, который опубликовал ее онлайн 4 сентября. Статье Шарпантье и Дудны повезло больше. Представленный в Science через 2 месяца после Шиксниса (8 июня) манускрипт прошел рецензирование меньше чем за месяц и был опубликован онлайн уже 28 июня. Обе группы четко понимали потенциал технологии, причем Шикснис заявил, что «эти открытия прокладывают путь для разработки универсальных программируемых РНК-управляемых ДНК-эндонуклеаз», а Шарпантье и Дудна отметили «потенциал использования системы для РНК-программируемого редактирования генома».

Эрика Ландера здесь нельзя назвать полностью беспристрастным: в этой статье он отстаивал приоритет не только далекого от США литовского ученого (который недавно все-таки получил признание по крайней мере в форме премии Кавли), но и последующий (и, конечно, очень весомый вклад) Чжан Фэна, который — будучи коллегой Ландера и сотрудником Института Брода — впервые провел аналогичный эксперимент. Только уже не в пробирке, а в настоящей живой клетке. Поразительно, что все это произошло в один и тот же год: статья Чжана вышла в январе 2013-го.

Константин Северинов, профессор Сколтеха и Университета Ратгерс

Формально работа Шарпантье, Дудны и соавторов была первой из тех, где было показано, что бактериальную систему защиты от вирусов можно использовать для создания программируемых нуклеаз, то есть «ножниц», которые раскусывают ДНК в том месте, в котором нужно. Вся остальная технология возникла из этого. Достаточно ли этого для Нобелевской премии — это отдельный вопрос. Конечно, здесь есть некоторая драма, связанная с тем, что ученые из Литвы, группа Виргиниюса Шиксниса, делала очень похожие опыты и показала очень похожие вещи. И есть какая-то некрасивая история про то, что их работы придерживали [при рецензировании], но кто и как это делал — неизвестно, так что в итоге работа Дудны и Шарпантье вышла первой в Science, а работа Шиксниса — позже и в [менее престижном журнале] PNAS. Поэтому я бы сказал, что именно Шикснис тут обойден вниманием, а не Фенг Чжан [приоритет которого отстаивает Эрик Ландер]. Хотя правда и в том, что именно он, Фенг, впервые показал работу этой системы в живых клетках, [а не в пробирке].

Сейчас разные группы исследователей, участвовавших в гонке CRISPR, вовлечены в патентные споры вокруг этой технологии, но попытки добиться какой-то объективности обречены на провал. Каждая из сторон уже высказала свое мнение, а независимые участники событий почти всегда молчат. Евгений Кунин отказался прокомментировать «Медузе» сегодняшнее объявление Нобелевского комитета, Александр Болотин сообщил, что ему нечего сказать кроме того, что «список претендентов тут очень длинный, и будут еще люди награждены», а Виргиниюс Шикснис оказался недоступен для комментария. Исключением стал еще один участник гонки Джордж Черч, который опубликовал схожую с Чжан Фэн работу в начале 2013-го. В разговоре с Science он сказал, что очень доволен выбором, а «Чжан Фэн настолько полон творческих идей, что, не сомневаюсь, он получит одну или две [Нобелевские премии] в будущем».

Как бы то ни было, вся эта жесткая конкурентная борьба за приоритет не должна отвлекать от главного — восемь лет назад у человечества появился уникальный инструмент исправления генов, и не так уж важно, кем именно и когда он был изобретен. В конце концов, еще ни один ученый не признался, что стал заниматься наукой только ради Нобелевской премии.

Александр Ершов