Разгадать «формулу» света

Международная группа ученых впервые создала стабильно светящиеся растения, перенеся в них ДНК из биолюминесцентных грибов. Статья была опубликована в Nature Biotechnology и привлекла внимание не только научного сообщества, но и мировых СМИ: растения из мира «Аватара» заметили в The Times, The Guardian, Vice, The Independent, CNN. В научную группу вошли исследователи из московского биотехнологического стартапа «Планта», Института биоорганической химии РАН (ИБХ), станции искусственного климата «Биотрон» и Института науки и технологий Австрии. Об их прекрасном, прежде всего эстетически, научном результате рассказывает научный журналист Александра Борисова.

Первый дом этой истории — Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова — один из ведущих институтов РАН с большой историей исследования люминесценции. В частности, в ИБХ делались важнейшие в России работы по исследованию флуоресцентных белков (в том числе знаменитого GFP) под руководством академика РАН, ныне ректора РНИМУ им. Н. И. Пирогова Сергея Лукьянова. Второй дом — в Сибири, в Красноярске, где находятся знаменитый Институт биофизики СО РАН (сейчас входящий в состав Красноярского научного центра СО РАН) и Сибирский федеральный университет.

Академик РАН Иосиф Гительзон инициировал мегагрант лауреата Нобелевской премии 2008 года за открытие GFP (зеленого флуоресцентного белка) Осаму Симомуры (Osamu Shimomura) — заявка оказалась успешной. Так появилась Лаборатория биолюминесцентных биотехнологий в Сибирском федеральном университете. Симомура пригласил к сотрудничеству коллег из московского ИБХ. Результатом стали две статьи в Angewandte Chemie, еще одна — в Proceedings of the National Academy of Sciences, а теперь коллектив вырос и дошел до Nature Biotechnology.

Рассказывает Илья Ямпольский, руководитель работы, зам. директора ИБХ РАН:

«Я окончил Высший химический колледж РАН и пришел в аспирантуру к одному из лучших биохимиков России Сергею Анатольевичу Лукьянову. Я пришел в 2000 году, а в 1999 году Лукьянов открыл красные флуоресцентные белки. В команде у С.А. тогда не было химиков, а химическая составляющая в этой работе есть — она досталась мне. Мы изучали, как устроены хромофоры — участки молекулы, отвечающие за флуоресценцию. Раз они светятся разными цветами — красным, желтым, синим, — значит, они различаются. В 2011 году в ­Красноярске ­по­явился мегагрант Симомуры, и Сергей Анатольевич поручил мне сотрудничество с этим коллективом».

Это означало новый фокус в работе — нужно было перейти от изучения флуоресценции к биолюминесценции. Эти понятия путают даже ученые (а также журналисты и комментировавшие в «Фейсбуке» новость об этой работе), однако они принципиально различаются. Флуоресценция — это процесс, в котором молекула сначала поглощает квант света, а потом отдает его — то есть свечение возникает только при предварительном облучении светом. Биолюминесценция — это явление самостоятельного свечения живых организмов, когда предварительного облучения не требуется. Специальная молекула под названием люциферин окисляется в присутствии кислорода, переходит в возбужденное состояние и потом разряжается с испусканием света; этот процесс катализируется ферментом, который называется люцифераза.

Разгадать «формулу света» очень непросто. Во-первых, нужно идентифицировать компоненты химической реакции, в результате которой происходит свечение; их нужно выделить и определить их структуру. Во-вторых — разобраться с ферментами, которые обеспечивают биосинтез этих веществ. В-третьих — найти гены, которые кодируют эти ферменты и люциферазу.

«Красноярский коллектив — хочется особенно упомянуть Валентина Петушкова, Наталью Родионову и Константина Пуртова — уже занимался изучением люминесцентного червя Fridericia heliota. Они сделали всю биохимическую работу — выделили вещества, которые участвуют в реакции, определяющей свечение. Мы подключились к этой работе — определили их структуру и синтезировали с нуля. Так мы работали и по грибам, и по червям. Провести синтез природного соединения в лаборатории очень важно по двум причинам. Во-первых, в живом организме природного вещества очень мало — при огромных усилиях можно выделить всего 5 микрограммов; а чтобы работать с ним, изучать его свойства, нужны сотни миллиграммов. Во-вторых, синтез — это независимое подтверждение структуры. Пока нет синтеза, любая структура — это гипотеза», — объясняет Илья.

Ученым удалось выявить «компоненты свечения» и для червя [1], и для светящихся грибов [2]. По результатам этой работы вышли две статьи в одном из главных химических журналов мира — Angewandte Chemie.

До этого люциферин грибов не удавалось получить никому. В принципе, было понятно, что у светящейся молекулы должен быть предшественник, из которого она и получается. Но как найти этот предшественник? Проблема для биохимии обычная: если искомого вещества мало, то обнаружить его непросто. Один из ключевых авторов работы — красноярский биофизик Константин Пуртов пошел нестандартным путем. Он решил, что молекулу-предшественник нужно искать в… несветящихся грибах. В собранной около Красноярска чешуйчатке обыкновенной было обнаружено достаточно большое количество вещества, которое при реакции с вытяжкой из светящегося вьетнамского гриба дает свет. Этим веществом стал хорошо известный антиоксидант гиспидин: специальный фермент в светящихся грибах перегоняет гиспидин в люциферин. После этого пришла пора искать ферменты, обеспечивающие свечение, — и гены, которые их кодируют.

«Десять лет мы занимаемся поиском ферментов, которые отвечают за биосинтез люциферина червя, — и это пока нам не зубам. Почему? Потому что ферменты не получается выделить из биомассы — они портятся, теряют свойства. Чтобы определить целевой фермент, нужно его очистить. И во время ­очистки он теряет активность, а очис­тить нужно в активном состоянии», — объясняет Илья Ямпольский.

То, что не получилось с червями, получилось с грибом. Путем долгой высокоуровневой научной работы — и толики везения.

«В грибах гены, кодирующие „ферменты свечения“, оказались собраны в один кластер. И когда мы нашли один, мы нашли всю кассету», — комментирует Ямпольский.

Работа, раскрывающая генетику биолюминесценции грибов, вышла в Proceedings of the National Academy of Sciences в 2018 году [3]. Это была вторая «полная формула света» — ранее был установлен механизм свечения бактерий. Теперь предстояла самая амбициозная задача — перенести обнаруженную кассету генов в другой организм и заставить ее там работать. С бактериями не получилось: это прокариотические одноклеточные организмы, и их гены «не прижились» в многоклеточных.

«Когда ты знаешь ответственные за биолюминесценцию ферменты, у тебя появляется возможность генетически ее закодировать. Тут аналогия с GFP (зеленым флуоресцентным белком). Только в GFP это один белок, который кодируется одним геном, а люминесценция кодируется в случае грибов четырьмя генами: три гена биосинтеза люциферина и один — люциферазы. Люцифераза катализирует окисление люциферина кислородом, в результате выделяется квант света. Получается кассета из генов, с помощью которой можно закодировать люминесценцию. Теперь мы эти гены можем пытаться переставить в другого хозяина так, чтобы он светился», — поясняет Илья.

Новая работа в журнале Nature Biotechnology [4] как раз об этом: идентифицированную систему люминесценции удалось перенести в табак. Получилось то, что итальянская газета La Repubblica [5] окрестила заголовком «Как в фильме „Аватар“», — растения, которые самостоятельно светятся в темноте без применения дополнительных веществ. Свечение табака — именно в него внесли гены грибов — можно наблюдать невооруженным глазом. Созданы растения с устойчивым свечением, превосходящим по яркости все предыдущие подходы, — растения производят более миллиарда фотонов в минуту.

«В конце концов, это просто очень красиво: когда ты видишь своими глазами свечение, это не может не впечатлять», — говорит Илья Ямпольский.

Сложность работы определила значительное, по меркам биологических исследований, число участников: авторами статьи в Nature Biotechnology являются 27 ученых. Работа велась под руководством Карена Саркисяна и Ильи Ямпольского, с ключевым вкладом Татьяны Митюшкиной, Александра Мишина, Луизы Гонзалез Сомермейер и Надежды Маркиной. Как уже говорилось выше, проведенное исследование — результат совместной работы московского биотехнологического стартапа «Планта», Института биоорганической химии РАН, станции искусственного климата «Биотрон» и Института науки и технологий Австрии. Основную финансовую поддержку оказали компания «Планта», Фонд Сколково и Российский научный фонд.

«Могло ничего не получиться? — спрашивает Илья. — Могло — потому что гены из одних организмов не обязаны работать в других. Они могли не захотеть работать в растениях — по самым разным причинам, потому что растения не грибы. Раковые модели не переносятся от мыши на человека и даже от обезьяны на человека. А грибы от растений гораздо дальше генетически, чем млекопитающие друг от друга».

Создание совершенно новых биологических свойств сложнее, чем просто перенос нескольких генов из одного организма в другой. Метаболизм растений подобен часовому механизму, и новые детали, элементы грибной биолюминесценции, необходимо идеально подогнать к нему — и это удалось.

Зеленое свечение исходит от листьев, стеблей, корней и цветов, его видно невооруженным глазом и можно заснять на обычные фотоаппараты и даже смартфоны. Что немаловажно, устойчивое свечение не мешает растениям нормально расти и развиваться.

Оказалось, что органическая молекула, необходимая для свечения грибов, используется и растениями для строительства клеточных стенок. Чтобы появился свет, эта молекула, называемая кофейной кислотой, должна пройти через метаболический цикл с участием четырех ферментов. Два фермента превращают кофейную кислоту в более сложную молекулу, которая затем окисляется третьим ферментом с испусканием фотона. Еще один фермент превращает продукт реакции обратно в кофейную кислоту, замыкая цикл.

В растениях кофейная кислота — строительный блок лигнина, ответственного за механическую прочность клеточных стенок. Таким образом, она является частью биомассы растений — лигноцеллюлозы, наиболее распространенного возобновляемого ресурса на Земле. Помимо этого, кофейная кислота необходима для синтеза пигментов, летучих соединений и антиоксидантов (несмотря на похожие названия, кофейная кислота и кофеин — два совершенно разных химических со­единения).

Таким образом, свечение и метаболизм растений тесно связаны, и потому свечение может отражать физиологический статус растений и их реакцию на окружающую среду. Например, растения светятся сильнее, если рядом с ними положить спелую банановую кожуру (которая выделяет растительный гормон этилен). Молодые побеги растений и, в особенности, цветы светятся ярче. Свечение постоянно меняется, может образовывать необычные узоры и волны на листьях растения, позволяя впервые наблюдать внутренние процессы, обычно скрытые от глаз. Свечение также зависит от состояния растения: при увядании листьев оно ослабляется, а при их повреждении, наоборот, увеличивается. Но наиболее сильное свечение дают не листья, а цветы. Очень ярко светятся корни, особенно точки их ветвления. Если отрезать побег, на этом месте начинает вырастать новый, и это место тоже светится очень ярко. Срезанная часть растения будет светиться до тех пор, пока она не засохнет.

Работа велась на двух видах табака — удобных экспериментальных объектах из-за особенности их генетики и быстрого роста. Однако система биолюминесценции грибов может быть перенесена и в другие растения. Как исследователями «Планты», так и участниками параллельного исследования, проведенного в Университете Миннесоты (США), продемонстрирована применимость нового подхода к созданию светящихся растений других видов, включая барвинок, петунию и розу. В будущем можно ожидать получения еще более ярких растений, в том числе с новыми свойствами — например, с изменением яркости или цвета свечения в ответ на людей и окружение.

«Тридцать лет назад я помог создать первое люминесцентное растение, использовав ген светлячков. Новые растения производят гораздо более яркое и устойчивое свечение, механизмы которого полностью встроены в их гены», — сказал Кит Вуд (Keith Wood), директор компании «Лайт Био» (Light Bio), которая, в партнерстве с «Плантой», планирует вывести на рынок светящиеся в темноте декоративные комнатные растения. Рыночные перспективы отметила газета The Times игрой слов в заголовке: «Комнатные растения, светящиеся мягким зеленым светом в результате генетической модификации, обещают садоводству яркое будущее» [6].

В темной комнате такие растения позволяют видеть предметы вокруг, стены, отмечают авторы, а после того как глаза привыкнут к темноте — даже разобрать текст. Кроме того, заставить светиться можно и животных.

Хотя сейчас у ученых нет готового коммерческого продукта на базе этой разработки, компания «Планта», созданная коллективом авторов статьи, уже работает над получением светящихся разновидностей традиционных декоративных растений.

«Идет работа над розами, орхидеями — всего около дюжины сортов. Первым светящимся ­растением на рынке будет, скорее всего, петуния — планируем начать продавать горшочки через два года. Мы хотим создать линейку растений и занять свои ниши во всех сегментах декоративных растений — от срезанных цветов до газонной травы и кустарников. Но только сейчас я осознаю, насколько большой и сложной целью является бизнес, даже если есть сильный научный задел. Нам нужен коммерческий продукт, а табак таким не является. Для вывода идеи на рынок нужно добиться необходимых потребительских качеств, получить много разрешений на продажу, обеспечить интеллектуальную собственность, наладить производство. Это новый и очень интересный вызов», — отметил Илья Ямпольский.

Применение результатов работы выходит за рамки эстетических: биолюминесценция пригодится ученым в решении исследовательских задач. Свечение можно будет использовать для наблюдения за внутренними процессами в растениях. В отличие от других широко используемых типов биолюминесценции, для поддержания стабильного свечения с помощью нового подхода не требуется добавления химических реагентов: растения, содержащие грибную ДНК, светятся непрерывно на протяжении всего жизненного цикла, с момента прорастания до цветения; ее можно использовать для изучения реакций растений на стрессы — высокую температуру или соленость, болезни. С опорой на эти данные можно, например, вывести устойчивые сорта.

«Было ли моей целью создать биолюминесцентные растения? Честно скажу, да, но десять лет назад это казалось малореальным. Для этого нужно было пройти слишком большой путь, и в возможность этого не верилось. Но оказалось, что мы его прошли — шаг за шагом. На свете существуют флуоресцентные генно-модифицированные организмы — котята, рыбки. А люминесцентных — не было, потому что не были известны гены, которые за это отвечают; известна была лишь бактериальная система, и работала она только в бактериях. Невозможно было получить биолюминесцирующие многоклеточные организмы — а нам это удалось. Мы открыли вторую генетическую биолюминесцентную систему — но уже не прокариотическую, а эукариотическую», — подытожил суть сделанного открытия Илья Ямпольский.

Фото предоставлены участниками проекта