В биофизике мембран масса открытых вопросов

Словацкий биофизик Норберт Кучерка (Norbert Kučerka), замдиректора по научной работе Лаборатории нейтронной физики Объединенного института ядерных исследований (ОИЯИ), рассказал Яну Махонину об изучении липидных мембран, перспективах лечения болезни Альцгеймера, а также о модернизации источника нейтронов в ОИЯИ.

— Вы работаете в области структурной биофизики. В исследовании липидных мембран вы применяете методы рассеяния — малоугловое рассеяние нейтронов и рентгеновских лучей. Каковы преимущества этого метода при изучении биологически значимых материалов по сравнению с классическими кристаллографическими методами?

— Биологические мембраны — это сильно разупорядоченные объекты. Большинство методов, основанных на кристаллографии, в их случае не срабатывает. Именно поэтому большую роль играют методы малоуглового рассеяния, дифракции рентгеновских лучей или нейтронов. Они позволяют определить основные параметры таких мембран. Одним из важнейших факторов является, конечно же, толщина, поскольку в биологии мембрана — это объект, отделяющий друг от друга два пространства, например внутреннее пространство клетки и внешнюю среду. Липидные мембраны полупроницаемы — это означает, что некоторые частицы среды проникают сквозь них. Какие именно и с какой скоростью — зависит в первую очередь от толщины мембраны, ее состава и механико-упругих свойств. Именно эти параметры можно определить методами рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей.

— В чем отличие этих методов?

— Их довольно сложно сравнивать. У каждого из них есть свои преимущества и недостатки. Один из лучших подходов — использовать их комплементарность: при проведении экспериментов наблюдать за объектами с помощью рассеяния как рентгеновских лучей, так и нейтронов и объединять полученные наблюдения, которые немного отличаются.

Главное отличие заключается в том, что в случае рентгеновских лучей происходит рассеяние на электронах, поэтому чувствительность этого метода зависит от того, из каких атомов состоит мембрана. В большинстве биологических материалов живых организмов много водорода, а водород плохо «виден» в рентгеновских лучах. Здесь на первый план выходят нейтроны. Они весьма чувствительны к легким атомам, таким как водород, и способны, например, распознать разницу между водородом и дейтерием — его изотопом. Если взять образец, в котором содержится водород или дейтерий, то с химической точки зрения никаких отличий нет, а нейтроны позволяют увидеть две кардинально разные картины. Это некий фильтр, через который мы рассматриваем образец. Так мы можем получить больше информации. С другой стороны, есть и определенный недостаток: интенсивность источников нейтронов, которыми мы располагаем на сегодняшний день, не достигает уровня источников рентгеновских лучей. Следовательно, уровень получаемых данных немного ниже, и прежде всего это касается разрешения. Нейтроны дают нам значимую информацию, но не столько о деталях, сколько об общих параметрах мембраны. В то же время рентгеновские лучи, благодаря лучшему разрешению, позволяют нам получить гораздо более детальную информацию. И, как я уже сказал, если объединить данные, полученные этими методами, мы получим более полную информацию об изучаемых мембранах.

— С помощью этих методов вы создаете модели субмолекулярных деталей мембран и их физических взаимодействий. Какую информацию дают эти модели?

— Одна из главнейших задач методологии биофизики мембран — определение структурных характеристик, как со статической, так и с динамической точек зрения. Структура мембраны определяется ее составом. Тот влияет на локализацию ее компонентов, которые, в свою очередь, имеют различное влияние на свойства мембраны. Широкой публике хорошо известен холестерин, который, например, встраивается в мембрану и приводит к увеличению ее упорядоченности и упругости. А это, естественно, ведет к снижению динамики мембраны, что влияет, в том числе, на транспортировку различных веществ сквозь мембрану.

— Как наличие тех или иных компонентов в мембране влияет на жизнь человека?

— Одни компоненты могут привести к заболеванию, а другие, наоборот, способствовать профилактике болезней. Белки — также очень важные компоненты мембран. Они представляют собой подобие моторов, активно транспортирующих вещества сквозь нее. Однако исправное функционирование белков опять же очень зависит от свойств мембраны, которые изменяются при наличии не только холестерина, но и различных ионов, присутствующих в организме повсеместно. С их помощью активируются или деактивируются различные процессы.

— Где и как возникает нейтронное излучение той интенсивности, которая необходима для проведения экспериментов по рассеянию? Какие возможности предоставляет вам оборудование Объединенного института ядерных исследований?

— Эта методика возникла не так давно, ей примерно сто лет. Нейтрон был открыт в 1930-е годы, и вскоре после того, как ученые пришли к теоретическому пониманию того, что такое нейтроны и как можно их «производить», был построен первый источник нейтронов. В то время это был ядерный реактор. Этот тип источника всё еще используется сегодня. У него есть свои плюсы и минусы. Другой способ получения нейтронов — это так называемые распадные источники, чуть более современные и более эффективные по сравнению с ядерными реакторами. В них не используется ядерное топливо, они более сложные, поэтому и затраты на них больше. Классические ядерные источники работают непрерывно, производя нейтроны сплошным потоком, в то время как большое преимущество распадных источников заключается в том, что они работают в пульсирующем режиме.

— В чем особенности импульсного реактора на быстрых нейтронах (ИБР), концепцию которого в 1955 году разработал в Дубне первый директор института Дмитрий Блохинцев?

— Блохинцев выдвинул идею объединить два вышеупомянутых вида источников нейтронного излучения и, по сути, разработал прототип импульсного ядерного реактора ИБР. Он был построен в Лаборатории нейтронной физики и затем несколько раз модернизировался, пока не достиг современной версии — ИБР-2М. Теперь он работает на мощности 2 МВт. Это, в сущности, классический ядерный реактор, в котором протекает реакция расщепления атомного ядра, однако происходит она в точно установленный момент времени, наступающий в режиме импульса, и поэтому этот реактор обладает и преимуществом импульсных распадных источников.

— В чем преимущество импульсного метода при производстве нейтронов?

— При ядерной реакции испускаются нейтроны различных энергий. Если мы хотим использовать их в эксперименте по измерению неизвестных структур, мы как минимум должны знать характер этих нейтронов. Это означает, что из тех нейтронов, которые были произведены, в случае ядерного реактора мы должны выбрать только те, которые обладают определенной энергией. К сожалению, во многих экспериментах из всей шкалы доступных энергий востребована лишь часть на уровне 1%. Оставшиеся 99% нейтронов, произведенных ядерными реакторами, мы не используем. Хотя импульсные источники тоже производят целый пакет энергий нейтронов, мы знаем точное время их возникновения и расстояние, которое они преодолели. Благодаря этому мы можем рассчитать их энергию. То есть несмотря на то, что получаем целый пакет энергий, мы способны определить их характеристики и, следовательно, использовать в наших экспериментах. Эффективность такого источника теоретически может приближаться к 100%.

ИБР объединяет в себе преимущества обоих упомянутых источников: он сохраняет сложность энергий, возникающих при ядерной реакции, однако благодаря своему импульсному характеру позволяет нам в них ориентироваться.

— Оборудование ИБР-2М работает несколько десятков лет. Оно всё еще полностью функционально? Планируется ли его дальнейшая модернизация, создание какой-либо новой модели?

— Сегодняшняя версия ИБР очень эффективна. Одного наполнения ядерным топливом, на котором работает реактор, хватает на 25 лет. ИБР-2 был сконструирован в 1972 году, в 1980-е он был запущен и проработал примерно 25 лет. Масштабная модернизация и замена топлива была осуществлена в 2006–2010 годах, а потом был вновь запущен ИБР-2М — уже, по сути, новый реактор, хотя и функционирующий на той же базе, что и его предшественник. Сейчас идет его следующий 25-летний рабочий цикл. Срок жизни этого источника нам известен довольно точно, и мы уже сейчас знаем, что нам придется создать новый. Сегодняшний реактор уже нельзя дальше модернизировать, да и здание реактора уже слишком старое, и когда истечет срок его эксплуатации, на него уже больше нельзя будет рассчитывать. Поэтому в Дубне разрабатываются проекты совершенно нового источника нейтронов, и вот уже два года ведется широкая дискуссия о том, каким должно быть это оборудование и на каких принципах оно должно функционировать.

— Что такое синхротронное излучение и как вы используете его для своих исследований?

— Источники рентгеновских лучей претерпели длительную эволюцию начиная с 1900 года. Сегодня синхротроны — лучшие источники рентгеновских лучей. Раньше синхротроны использовались только для ускорения частиц, однако новые их поколения были изготовлены непосредственно для получения рентгеновских лучей. Сегодня они относительно широко распространены в мире, но, к сожалению, в ОИЯИ их нет. Около 10 лет назад здесь планировали построить синхротрон, однако проект не реализовали. Ближайший, уже устаревший, ускоритель находится в Курчатовском институте в Москве. Поэтому ОИЯИ наладил двустороннее сотрудничество с Польшей, где недавно возвели современный синхротрон SOLARIS. Мы планируем построить несколько измерительных установок в синхротронном центре, где он расположен.

— Какие еще приборы вы используете в своих исследованиях в ОИЯИ?

— Есть источники рентгеновского излучения гораздо меньших масштабов, и очень популярны различные компактные устройства, в основном небольшие коробки, которые можно разместить непосредственно в лаборатории. Они основаны на рентгеновских лампах, их интенсивность гораздо меньше, чем у синхротронов, но она достаточна для базовых экспериментов. Когда станет необходимо увеличить интенсивность, мы будем использовать синхротрон.

— В чем заключается модель SDP — профиля плотности рассеяния, которую вы разработали?

— Модель SDP позволяет объединить эксперименты, которые проводятся с помощью нейтронного и рентгеновского излучений — они всегда осуществлялись независимо друг от друга. SDP дает возможность при описании мембраны одновременно использовать информацию, полученную этими методами. Хотя у меня нет на нее патента, но разработал ее я лично, и сегодня этой моделью уже пользуются другие научные группы и лаборатории.

— Как работает алгоритм и конечное программное обеспечение SIMtoEXP — еще одной вашей разработки?

— Экспериментальный метод позволяет получать различную информацию о структуре мембраны, но остается еще более детальная информация, которая нам пока недоступна. Сегодня очень популярен метод вычислительного моделирования, которое основано на чисто теоретических расчетах. Но даже несмотря на развитие компьютерной техники многие исследователи, к сожалению, используют слишком большую степень приблизительности.

Чтобы в рамках такого моделирования создать мембрану, одного липида недостаточно, и берется, к примеру, 128 молекул липидов и множество молекул воды вокруг, так что количество атомов там — от ­нескольких тысяч до нескольких миллионов, и в вычислениях необходимо рассчитывать позиции и изменения позиций каждого из них. Это, конечно, нереально, и поэтому используются различные приближения. Пройдут годы, прежде чем эти приближения будут проверены на практике, и даже в научной литературе часто публикуется огромное количество полученных с ­помощью вычислений результатов, которые в лучшем случае недостоверны, а в худшем — ложны.

Долгие годы мы боролись за то, чтобы каждый такой результат, прежде чем он превратится в сенсацию, проверялся экспериментальным путем. И SIMtoEXP — это именно та программа, которая применительно к моделям мембран на базовом уровне может справиться с этой задачей. Она напрямую сравнивает результаты моделирования, созданные на компьютере, с экспериментальными измерениями, проведенными с помощью рассеяния нейтронов или рентгеновских лучей. В хороших статьях сегодня почти всегда приводятся параллельно результаты теоретического моделирования и эксперимента.

— В Чехии и Словакии нет такого оборудования, которое есть в Дубне? Какие еще страны им располагают?

— Институт для Словакии и Чешской Респуб­лики явно незаменим, особенно с точки зрения источников нейтронов. В Словакии у нас вообще нет источника нейтронов, а в Чехии есть ядерный реактор в Ржеже, он может частично покрывать наши потребности, но на более низком уровне. Мы также можем обратиться во Францию, например, — там есть большой источник нейтронов. Скоро завершится строительство крупного источника в Швеции. Но, учитывая, что Чехия и Словакия — страны-члены ОИЯИ, реактор в Дубне для нас идеальный и наиболее доступный источник нейтронов.

— Как развивались исследования в области липидных мембран по сравнению с классической жидкостно-мозаичной моделью, предложенной Сингером и Николсоном в 1972 году?

— Со времен этой первой модели биофизика проделала огромный путь развития. Тогда предполагалось, что главную роль играют липидные части мембраны, а белки рассеяны в ней в небольшом количестве. Со временем оказалось, что белков там намного больше, мембрана намного плотнее и там происходят гораздо более значительные взаимодействия между белками. Потом выяснилось, что и липидная часть не так проста, как первоначально думали. В биологических веществах нам уже известно много разных липидов, и мы знаем, что различные типы липидов в больших количествах естественным образом существуют в мембранах. Эти липиды группируются в так называемые домены и формируют вдоль мембраны дополнительные структуры, которые первоначальная модель не учитывала. Именно этой дополнительной структуре сегодня приписывается большое значение. В каждой органелле или клетке, в которой находится мембрана, она выполняет невероятное множество функций. Эти функции зависят от конкретных параметров мембраны и часто сильно отличаются друг от друга по своим требованиям. Именно поэтому мы предполагаем, что выполнить конкретные условия можно только на локальном уровне путем формирования доменов, которые отличаются друг от друга по составу липидов. Таким образом, возникает некая мозаика, в которой разные процессы протекают в разных доменах, причем они совместно выполняют комплексную функцию биологической мембраны.

— С какими конкретно компонентами липидных мембран связаны ваши исследования?

— Я занимался, помимо прочего, влиянием холестерина на свойства мембраны. В ходе исследований выяснилось, что не только холестерин меняет ее свойства, но и липидный состав мембраны тоже влияет на холестерин, на его положение в ней. Благодаря методу рассеяния нейтронов оказалось, что при классическом составе мембраны, которая при всей своей упорядоченности плотная, холестерин встраивается в нее параллельно с липидами и затем увеличивает ее плотность. Но липиды, которые находятся в организме человека, прежде всего в области центральной нервной системы или в мембранах органелл и клеток глаз, мозга и т. д., намного менее упорядоченные, у них много двойных связей. И эта неупорядоченность достигает такого уровня, что холестерин уже не способен протиснуться в эту мембрану в своей первоначальной ориентации. Он перемещается в ее центр и при этом поворачивается на 90°.

— На что это влияет?

— Это существенно меняет общие свойства мембраны и к тому же дает нам возможность взглянуть на поэтапный механизм прохождения холестерина сквозь мембрану. Молекула холестерина слишком велика для того, чтобы она смогла просто так, сама по себе, сквозь нее проникнуть. Это могут сделать разве что ионы или молекулы воды. И здесь играют важную роль продольно расположенные домены. На одном локальном участке холестерин встраивается в мембрану классическим способом, остается в ней и может двигаться вдоль нее относительно свободно. Но при этом он может натолкнуться на домен, который гораздо менее упорядочен и заставляет его переместиться внутрь мембраны. Так он продвигается дальше, пока не натолкнется на следующий участок, который, опять же, обладает большей плотностью и возвращает его в первоначальное положение, но уже с другой стороны мембраны. Таким способом он может проникнуть внутрь клетки или из клетки наружу.

— Как результаты этих исследований применяются в медицине и фармакологии?

— Наши исследования, по сути, фундаментального уровня, то есть наши результаты не имеют непосредственного применения. Хотя и на этом фундаментальном уровне мы приходим к моделям механизмов перехода холестерина и иных взаимодействий, имеющих потенциал, чтобы стать прикладными и применяться в фармакологии и областях, связанных со здоровьем человека. Мембраны часто используются как переносчики лекарственных средств или генетической информации. Сегодня мы можем приготовить и охарактеризовать биосовместимые объекты из липидов в такой форме, что они создают некую капсулу, которую можно заполнить лекарством или ДНК. В них можно добавить различные химические сенсоры, направить их и присоединить на необходимые места. Или туда можно внедрить различные магнитные материалы и с помощью внешних магнитных полей направить эти объекты туда, куда понадобится.

— Какое значение может иметь ваше исследование структурных изменений липидной мембраны для лечения болезни Альцгеймера?

— Наряду с холестерином мы исследовали мелатонин — эта молекула также влияет на мембрану. Холестерин делает мембрану более жесткой, а мелатонин, напротив, — более текучей. И именно с изменением ее текучести связано множество моделей процессов, которые используются, в частности, при объяснении различных дефектов функций и различных заболеваний. Болезнь Альцгеймера — одна из них. Мы знаем, что белки, встроенные в мембрану, меняются, на них «нападают» различные ферменты, которые их разлагают. Существует специальный процесс, при котором от одного вида белков отрезаются части, которые выступают из мембраны, и в ней остаются другие части — пептиды. Они со временем покидают мембрану и начинают агрегировать и составлять структуры от больших до микроскопических. Их уже сто лет назад обнаружил Алоис Альцгеймер при обследовании пациентов с болезнью, позже названной его именем. Хотя до сих пор считается, что эти агрегаты непосредственно связаны с болезнью Альцгеймера, этот механизм, да и в целом эта болезнь до сих пор не объяснены, и существует множество моделей. Одна из основных проблем состоит в том, что мы не знаем, когда, как и почему пептиды, которые возникают в мембране, проникают из нее наружу и начинают агрегировать. Нам представлялось довольно интересным эту проблему проверить с точки зрения текучести мембраны. Мы создаем модели мембраны, где можем регулировать текучесть добавлением холестерина или мелатонина, и наблюдаем, начинает ли из-за этого изменения текучести меняться процесс встраивания пептидов. Мы ищем способ заставить пептиды остаться или, наоборот, покинуть мембрану.

— Какие результаты вы уже получили?

— Пока мы только умеем регулировать текучесть мембраны, а сейчас начинаем исследовать, какое влияние она имеет на пептиды. Мы их будем добавлять в модельные мембраны, которые у нас уже проверены, и проводить эксперименты на них.

— Какими вы видите дальнейшие перспективы биофизики в целом и в вашей отрасли?

— В биофизике мембран есть огромная масса открытых вопросов, модели улучшаются. Но речь не идет только о постепенной эволюции. Регулярно происходят и революционные моменты, когда кто-то предлагает совершенно новую переломную модель, которая открывает другие взгляды на существовавшие до сих пор механизмы. В целом в биофизике я не чувствую никакого тупика, эта отрасль будет процветать еще долгие годы. При этом я должен еще раз подчеркнуть, что хотя большинство исследований мы ведем на фундаментальном уровне, их результаты обладают настолько конкретным потенциалом, что влияют на прикладные области, связанные с повседневной жизнью, — медицинскую, фармацевтическую и т. д.

— В 2000–2001 годах вы впервые были на стажировке в Лаборатории нейтронный физики имени Франка ОИЯИ. Почему вы выбрали именно этот институт?

— Именно потому, что он был доступен для словаков. Это было начало моей аспирантуры, и стажировку в Дубне мне предложил мой научный руководитель. Работа в Дубне в те годы дала старт моей карьере. Я многому здесь научился, оказался в обществе интересных ученых, и я очень им благодарен.

Атмосфера в ОИЯИ для меня была безмерной мотивацией. Даже короткие встречи были важны. Благодаря доступности приборов и оборудования я смог провести ряд экспериментов, которые в Словакии были невозможны. Если это выразить по-дилетантски, у нас здесь была возможность поиграть.

— Кто лично был для вас важен из ученых в Дубне?

— Прежде всего — мой научный руководитель, профессор Павел Степанович Балгавы (Pavol Balgavý), который еще в Братиславе курировал мое обучение в аспирантуре. Во время пребывания в Дубне на меня также повлияли в научном плане Ахмед Исламов и Валентин Горделий.

— Чуть позже вы были на стажировке во Франции, в Центре ядерных исследований в Сакле. Он сильно отличается от ОИЯИ?

— Если сравнивать с точки зрения уровня жизни, между Дубной и Сакле в то время, конечно, разница была. Но по научному уровню ОИЯИ не уступал. Стажировка в Дубне для меня имела даже большее значение; может быть, оттого, что была первой. В Сакле на меня большое влияние оказал Жозе Тешейра (José Teixeira), с которым я до сих пор общаюсь.

— Как вы принимали решение — работать на Западе или в России?

— Вопрос никогда не стоял так: работать на Западе или на Востоке. Всегда решающей была научная составляющая: есть ли техника для работы, хорошая научная атмосфера и хорошая научная группа.

Когда я окончил обучение в аспирантуре, уехал в США, в Университет Карнеги — Меллона в Питтсбурге. Меня позвал туда на пост-докторантскую программу Джон Нейгл (John Nagle). Он как раз искал человека в свою группу. Лично мы до этого не встречались, но по статьям мы друг друга знали. Джон Нейгл — еще одна выдающаяся личность, повлиявшая на меня. Для исследований он в большей степени использовал рентгеновское излучение на синхрофазотронах, и я тоже стал уделять ему больше внимания. До этого я в основном работал с нейтронами. Я оставался у него в 2003–2006 годах, а потом получил новое предложение от профессора Джона Катсараса (John Katsaras) из Канадского центра нейтронного излучения Национальной академии наук Канады и дал себя переманить на новое место. Там был ядерный реактор, и я опять вернулся к нейтронам. Сотрудничество с Джоном Катсарасом продолжалось восемь лет, и я считаю его третьей вехой, сильно повлиявшей на мою карьеру.

— Почему вы решили уехать из Канады в Дубну?

— Мой отъезд из Канады был связан с окончанием срока эксплуатации тамошнего реактора. Ему оставалось работать еще два года, и тогда ко мне обратились из Дубны. Я принял предложение, хотя провел в Канаде восемь лет, начал там формировать свою группу, с которой проводил первые эксперименты, и там была отличная научная атмосфера. Но было ясно, что когда реактор закончит свою работу, всё это развалится.

— Вы сохранили рабочие контакты со своей канадской группой?

— Да, со многими из бывших коллег мы продолжаем сотрудничать, хотя у каждого из них есть своя группа. Мы работаем совместно, в основном дистанционно, над общими темами, публикуем статьи в соавторстве. Но иногда мы встречаемся и лично, а иногда даже и во время экспериментов. А в прошлом году я участвовал в симпозиуме в Канаде, посвященном 60-летию Джона Катсараса.

— С 2014 года вы работаете в ОИЯИ заместителем директора по науке Лаборатории нейтронный физики имени Франка. Вам хватает времени на науку?

— На науку у меня остается достаточно времени и пространства. Работа руководителем научной группы доставляет мне большую радость. Несмотря на административную должность, я постоянно полноценно руковожу научной группой, хожу на эксперименты, слежу за обработкой данных, написанием статей и т. д. Эта деятельность усилилась после того, как мы получили грант от Российского научного фонда (№ 19–72–20186).

— ОИЯИ находится на территории России, но по уставу у него международная правосубъектность. Каковы преимущества и недостатки такого статуса?

— Мы стремимся к международной правосубъектности института, хотя, возможно, она и не стопроцентная; то, что мы находимся на территории России, играет свою роль. Но думаю, что международный статус должен быть однозначным приоритетом. В тяжелые политические времена, которые переживает Россия, он дает многие преимущества. Институт лучше воспринимается зарубежными организациями, чем если бы он был чисто российским. Поэтому руководство нашего учреждения всегда старается на встречах и конференциях по всему миру напоминать, что мы — международный институт.

Фото Елены Пузыниной